کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High-Performance Liquid Chromatography – HPLC) یکی از پرکاربردترین تکنیک‌های تجزیه‌ای در صنعت داروسازی است. این روش به دلیل دقت بالا، تکرارپذیری، و قابلیت تفکیک ترکیبات پیچیده، برای تجزیه و تحلیل داروها، کنترل کیفیت، و تضمین تطابق با الزامات قانونی به‌طور گسترده استفاده می‌شود. در این مقاله، اصول، اجزای دستگاه، توسعه روش، کاربردها، مشکلات رایج و جنبه‌های نظارتی HPLC را بررسی خواهیم کرد.
۱. اصول کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
۱.۱. اساس کار HPLC
HPLC یک روش کروماتوگرافی مایع است که در آن ترکیبات یک نمونه، بر اساس برهم‌کنش آن‌ها با فاز ساکن و فاز متحرک، از یکدیگر جدا می‌شوند. این روش بر اساس اصول زیر عمل می‌کند:
• فاز متحرک: یک حلال یا ترکیبی از حلال‌ها که نمونه را از میان ستون عبور می‌دهد.
• فاز ساکن: یک ماده پرکننده در داخل ستون که ترکیبات نمونه را بر اساس ویژگی‌های شیمیایی‌شان به درجات مختلف جذب می‌کند.
• جداسازی ترکیبات: مولکول‌هایی که برهم‌کنش قوی‌تری با فاز ساکن دارند، دیرتر از ستون خارج می‌شوند، درحالی‌که ترکیباتی با برهم‌کنش ضعیف‌تر سریع‌تر از ستون عبور می‌کنند.
۱.۲. انواع HPLC بر اساس نوع جداسازی
• کروماتوگرافی فاز معکوس (RP-HPLC) – رایج‌ترین روش، که در آن فاز ساکن غیرقطبی (مانند C18) و فاز متحرک قطبی (مانند آب/متانول) است.
• کروماتوگرافی فاز نرمال (NP-HPLC) – در این روش، فاز ساکن قطبی و فاز متحرک غیرقطبی است.
• کروماتوگرافی تعویض یونی (Ion Exchange HPLC) – برای جداسازی یون‌ها و ترکیبات باردار.
• کروماتوگرافی اندازه-حذفی (Size Exclusion HPLC) – بر اساس اندازه مولکولی، مخصوصاً برای پروتئین‌ها و پلیمرها.
۲. اجزای اصلی دستگاه HPLC
۲.۱. پمپ (Pump)
پمپ نقش مهمی در جریان پایدار فاز متحرک دارد و فشار مورد نیاز برای عبور مداوم مایع را تأمین می‌کند. انواع پمپ‌ها شامل:
• پمپ ایزوکراتیک (Isocratic Pump) – فاز متحرک با ترکیب ثابت در طول آزمایش.
• پمپ گرادیانی (Gradient Pump) – ترکیب فاز متحرک در طول جداسازی تغییر می‌کند.
۲.۲. انژکتور (Injector)
نمونه از طریق لوپ تزریق (Injection Loop) وارد سیستم می‌شود. روش‌های رایج شامل تزریق دستی و اتوسمپلر (Auto-sampler) هستند.
۲.۳. ستون (Column)
مهم‌ترین بخش HPLC که در آن جداسازی ترکیبات صورت می‌گیرد. انواع ستون‌های رایج:
• C18 و C8 برای روش RP-HPLC
• سیلیکا (Silica) برای روش NP-HPLC
• ستون تعویض یونی برای آنالیز یون‌ها
۲.۴. آشکارساز (Detector)
آشکارسازها سیگنال‌هایی متناسب با غلظت ترکیبات خروجی از ستون تولید می‌کنند. انواع متداول شامل:
• UV-Vis Detector – بر اساس جذب نور فرابنفش/مرئی
• Fluorescence Detector (FLD) – برای ترکیبات دارای خاصیت فلورسانس
• Mass Spectrometry (MS) – بسیار حساس، برای تأیید ساختار مولکولی
۲.۵. سیستم جمع‌آوری داده (Data System)
نرم‌افزارهای کروماتوگرافی مانند Chromeleon، Empower و OpenLab برای ثبت، پردازش و تفسیر داده‌های HPLC استفاده می‌شوند.
۳. توسعه روش در HPLC
۳.۱. انتخاب شرایط کروماتوگرافی
• انتخاب ستون مناسب (C18 برای داروهای آلی، فاز نرمال برای ترکیبات قطبی)
• انتخاب فاز متحرک (آب/متانول، بافر فسفات، استونیتریل)
• تنظیم دما و نرخ جریان (Flow Rate)
۳.۲. اعتبارسنجی روش (Method Validation)
مطابق ICH Q2(R1)، پارامترهای مهم برای اعتبارسنجی شامل:
✔ دقت (Precision)
✔ صحت (Accuracy)
✔ حساسیت (LOD, LOQ)
✔ پایداری سیستم (System Suitability)
۴. کاربردهای HPLC در صنعت داروسازی
✔ کنترل کیفیت (QC): بررسی خلوص مواد اولیه و محصولات نهایی.
✔ آنالیز دارویی: تعیین مقدار مواد مؤثره (API) در قرص، کپسول، شربت و تزریقات.
✔ بررسی ناخالصی‌ها: شناسایی و کمّی‌سازی ناخالصی‌های ناشی از سنتز یا تجزیه.
✔ مطالعات پایداری: تعیین ماندگاری داروها تحت شرایط مختلف محیطی.
✔ فارماکوکینتیک و بیوانالیز: بررسی جذب، توزیع، متابولیسم و دفع داروها در بدن.
۵. مشکلات رایج در HPLC و راهکارهای رفع آن‌ها
۵.۱. کاهش فشار یا عدم جریان فاز متحرک
🔹 علت: گرفتگی فیلترها یا مسدود شدن مسیر
✅ راه‌حل: شستشوی سیستم با ایزوپروپانول یا تعویض فیلترها
۵.۲. کاهش شدت پیک‌ها در کروماتوگرام
🔹 علت: خرابی لامپ UV یا انحلال نامناسب نمونه
✅ راه‌حل: بررسی شدت نور لامپ، تهیه نمونه جدید
۵.۳. افزایش نویز پایه (Baseline Noise)
🔹 علت: آلودگی ستون یا تغییر در ترکیب فاز متحرک
✅ راه‌حل: شستشوی ستون، استفاده از فاز متحرک تازه
۶. جنبه‌های نظارتی (Regulatory Aspects) در HPLC
در صنعت داروسازی، آزمایش‌های HPLC باید با الزامات سازمان‌های نظارتی جهانی مانند FDA، EMA، USP، ICH مطابقت داشته باشند. برخی از استانداردهای کلیدی عبارتند از:
• ICH Q2(R1): راهنمای اعتبارسنجی روش‌های تحلیلی
• USP <621>: استانداردهای کروماتوگرافی مایع
• FDA 21 CFR Part 11: الزامات ثبت الکترونیکی داده‌ها
برای تأیید کیفیت داروها، تمامی روش‌های HPLC باید اعتبارسنجی (Validation) شوند و نتایج آن‌ها در گزارش‌های رسمی ثبت گردد.
جمع‌بندی
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک ابزار کلیدی در کنترل کیفیت داروها، آنالیز مواد مؤثره، شناسایی ناخالصی‌ها و مطالعات پایداری است. این روش با دقت بالا، حساسیت قابل توجه و تطابق با استانداردهای نظارتی جهانی، جایگاه ویژه‌ای در صنایع داروسازی دارد.
🔹 اگر قصد دارید در حوزه کروماتوگرافی و کنترل کیفیت دارویی فعالیت کنید، یادگیری اصول HPLC و استانداردهای مربوطه، یک مهارت ضروری برای شما خواهد بود.
📌 آیا شما تجربه‌ای در کار با HPLC دارید؟ تجربیات خود را در بخش نظرات با ما به اشتراک بگذارید!
