آزمون بردفورد یکی از روش‌های پرکاربرد برای تعیین غلظت پروتئین در یک نمونه است. این روش بر اساس اتصال یک رنگ، به نام کوماسی بریلیانت بلو G-250، به پروتئین‌ها استوار است که منجر به تغییر در جذب رنگ می‌شود. این آزمون به دلیل سادگی، سرعت و حساسیت بالای خود، ابزاری ارزشمند در زیست‌شناسی مولکولی، بیوشیمی و مطالعات مختلف مربوط به پروتئین‌ها است.
اصل آزمون بردفورد
آزمون بردفورد بر اساس این اصل عمل می‌کند که رنگ کوماسی بریلیانت بلو G-250، زمانی که به پروتئین‌ها متصل می‌شود، تغییر در حداکثر جذب خود نشان می‌دهد. در حالت آزاد، رنگ دارای یک پیک جذب در حدود 465 نانومتر است. اما زمانی که به مولکول‌های پروتئین متصل می‌شود، رنگ تغییر شکل می‌دهد و حداکثر جذب آن به 595 نانومتر منتقل می‌شود. این تغییر به غلظت پروتئین متناسب است و امکان کمی‌سازی آن از طریق اندازه‌گیری جذب فراهم می‌شود.
این آزمون بر اساس اتصال رنگ به اسیدهای آمینه‌ی پایه‌ای مانند آرژینین و لیزین و همچنین اسیدهای آمینه‌ی آروماتیک مانند تیروزین و تریپتوفان است. بنابراین، محتوای پروتئینی یک نمونه می‌تواند با اندازه‌گیری تغییرات جذب در 595 نانومتر و مقایسه آن با منحنی استاندارد تخمین زده شود.
روش انجام آزمون
- مواد و تجهیزات
- رنگ کوماسی بریلیانت بلو G-250
- استانداردهای پروتئینی (معمولاً آلبومین سرم گاوی، BSA)
- اسپکتروفوتومتر قادر به اندازه‌گیری جذب در 595 نانومتر
- لوله‌های آزمایش یا میکروپلیت‌ها برای تحلیل نمونه‌ها
- آماده‌سازی
- آماده‌سازی سری‌های استاندارد پروتئینی با غلظت‌های شناخته شده.
- آماده‌سازی محلول بردفورد با حل کردن رنگ کوماسی بریلیانت بلو G-250 در یک بافر اسید فسفریک.
- انتقال مقادیر مشخصی از استانداردهای پروتئینی به لوله‌های آزمایش یا چاهک‌های میکروپلیت.
- افزودن محلول بردفورد به هر چاهک/لوله آزمایش و مخلوط کردن کامل.
- انکوباسیون
- اجازه دادن به واکنش برای توسعه در دمای اتاق به مدت حدود 5 دقیقه. در این زمان، رنگ به پروتئین‌ها متصل می‌شود و تغییر رنگ رخ می‌دهد.
- برای نتایج دقیق، ضروری است که واکنش قبل از اندازه‌گیری جذب تکمیل شود.
- اندازه‌گیری
- اندازه‌گیری جذب در 595 نانومتر با استفاده از اسپکتروفوتومتر یا میکروپلیت خوان. یک نمونه خالی که فقط محلول بردفورد (بدون پروتئین) دارد باید برای صفر کردن دستگاه استفاده شود.
- ثبت مقادیر جذب در مقابل غلظت‌های شناخته شده استانداردهای پروتئینی برای ایجاد منحنی استاندارد.
- محاسبه
- استفاده از منحنی استاندارد برای تعیین غلظت پروتئین نمونه‌های ناشناخته با یافتن غلظت متناسب با جذب اندازه‌گیری شده.
مزایای آزمون بردفورد
- سرعت: آزمون بردفورد می‌تواند در مدت زمان چند دقیقه تکمیل شود و روشی کارآمد برای کمی‌سازی سریع پروتئین است.
- حساسیت: این روش به ویژه به غلظت‌های پایین پروتئین حساس است، که آن را برای کمی‌سازی مقادیر کم پروتئین در نمونه‌ها ایده‌آل می‌سازد.
- نیاز کم به نمونه: این آزمون تنها به حجم کمی از نمونه نیاز دارد که آن را برای نمونه‌های محدود مناسب می‌سازد.
محدودیت‌ها
- تداخل: برخی ترکیبات مانند شوینده‌ها، اجزای بافر یا عوامل کاهنده می‌توانند با دقت آزمون تداخل ایجاد کنند و خواص اتصال رنگ را تغییر دهند.
- تنوع پروتئینی: کارایی اتصال رنگ می‌تواند بین پروتئین‌های مختلف متفاوت باشد که این ممکن است منجر به تفاوت‌هایی در کمی‌سازی پروتئین‌ها شود. به همین دلیل معمولاً توصیه می‌شود منحنی استاندارد با استفاده از نوع پروتئین مشابه (مانند BSA) ایجاد شود.
- محدوده دینامیکی: اگرچه آزمون بردفورد حساسیت بالایی دارد، اما محدوده دینامیکی آن محدود است، به‌ویژه برای غلظت‌های بسیار بالا از پروتئین. برای چنین نمونه‌هایی، ممکن است نیاز به رقیق‌سازی نمونه باشد.
کاربردها
آزمون بردفورد در بسیاری از زمینه‌های تحقیقاتی و صنعتی استفاده می‌شود، از جمله:
- خالص‌سازی پروتئین: در فرآیند خالص‌سازی پروتئین‌ها، محققان از آزمون بردفورد برای نظارت بر غلظت پروتئین‌ها در مراحل مختلف استفاده می‌کنند.
- آزمون‌های آنزیمی: این روش به طور معمول برای کمی‌سازی پروتئین‌های دخیل در واکنش‌های آنزیمی استفاده می‌شود.
- زیست‌شناسی سلولی: در مطالعات مربوط به لیزات سلولی، آزمون بردفورد به اندازه‌گیری محتوای پروتئینی کل نمونه کمک می‌کند.
نتیجه‌گیری
آزمون بردفورد به عنوان یکی از پرکاربردترین روش‌های کمی‌سازی پروتئین به دلیل سادگی، سرعت و حساسیت بالا باقی می‌ماند. علیرغم محدودیت‌های آن، این روش ابزاری ارزشمند در بسیاری از محیط‌های آزمایشگاهی است که نیاز به اندازه‌گیری سریع و دقیق غلظت پروتئین دارند. با درک اصول، مزایا و معایب آن، محققان می‌توانند به طور مؤثر از آزمون بردفورد در کاربردهای مختلف بیوشیمی پروتئین‌ها استفاده کنند.
