نحوه انجام رقت های سریالی (به همراه محاسبات)

روش رقیق سازی سریالی اولین بار در سال 1883 توسط دانشمند و پزشک آلمانی رابرت کوخ هنگامی که کار خود را در مورد عوامل ایجاد کننده بیماری های عفونی منتشر کرد، توصیف شد و اکنون یک تکنیک استاندارد در آزمایشگاه های امروزی است. در این مقاله موارد زیر بررسی می شوند:

• رقت‌سازی سریالی چیست
• نمونه‌هایی از کاربردهای رایج آن
• نحوه انجام رقت‌سازی سریالی
• محدودیت‌های این تکنیک

نمونه‌هایی از رقت سریالی

از آنجا که غلظت نمونه‌ها، معرف‌ها، مواد شیمیایی و ترکیبات در تقریباً هر آزمایشگاه نقشی حیاتی ایفا می‌کند، رقت سریالی می‌تواند به‌عنوان یک تکنیک استاندارد آزمایشگاهی با کاربردهای بی‌شماری در نظر گرفته شود. در ادامه، نمونه‌هایی از روندهای رایج رقت سریالی در زمینه‌های میکروبیولوژی و داروسازی، و همچنین یک نمونه کلی‌تر آورده شده است.

میکروبیولوژی

رقت‌های سریالی به‌طور معمول در میکروبیولوژی برای تخمین تعداد میکروارگانیسم‌ها در نمونه‌ای با غلظت نامعلوم استفاده می‌شوند. تصور کنید که یک لوله کشت باکتری دارید و می‌خواهید بدانید چند سلول باکتری در آن در حال رشد هستند. از آنجا که هر میلی‌لیتر محیط می‌تواند حاوی یک میلیارد باکتری باشد، شمارش آن‌ها در چنین غلظت‌های بالایی غیرممکن است. به همین دلیل شما باید بخش کوچکی از کشت باکتری خود را رقیق کنید تا به غلظت قابل شمارش‌تری بین ۳۰ تا ۳۰۰ سلول باکتری در میلی‌لیتر برسید. با این حال، برای رسیدن به چنین غلظت پایینی از یک نمونه با یک میلیارد باکتری در میلی‌لیتر در مرحله یک، باید یک میلی‌لیتر از نمونه را در ۱۰,۰۰۰ لیتر رقیق‌کننده رقیق کنید. یک روش جایگزین و عملی‌تر، انجام رقت سریالی است. پس از رقیق‌کردن یک میلی‌لیتر از نمونه با یک میلیارد سلول باکتری در میلی‌لیتر در ۹ میلی‌لیتر رقیق‌کننده، شما غلظتی معادل ۱۰۰ میلیون سلول باکتری در میلی‌لیتر خواهید داشت (شکل ۱، مرحله ۱). رقیق‌کردن یک میلی‌لیتر از این رقت در ۹ میلی‌لیتر رقیق‌کننده به شما این امکان را می‌دهد که غلظت باکتری‌ها را به ۱۰ میلیون سلول در میلی‌لیتر کاهش دهید (شکل ۱، مرحله ۲) و به همین ترتیب. این بدان معناست که شما می‌توانید به غلظت قابل مدیریتی از ۱۰۰ سلول باکتر ی در میلی‌لیتر در ۷ مرحله رقت برسید و تنها ۶۳ میلی‌لیتر رقیق‌کننده مصرف کنید.

روش ذکر شده در مثال بالا زمانی که بخواهید یک نمونه با غلظت بالا را رقیق کنید تا به یک غلظت قابل مدیریت برسید، بسیار مؤثر است. با این حال، گاهی اوقات ممکن است بخواهید برعکس عمل کنید. به عنوان مثال، هنگام آزمایش منابع آب برای آلودگی با باکتری‌های کولایفرم، غلظت باکتری‌ها معمولاً بسیار پایین است. در این حالت، روش تعداد احتمالی (MPN) تکنیکی است که برای تخمین تعداد سلول‌های باکتری در یک نمونه باید انتخاب شود. اگر می‌خواهید بیشتر درباره روش MPN بدانید، مقاله ما با عنوان “رقت‌های سریع و دقیق برای روش آزمون تعداد احتمالی با استفاده از DOSE IT” را مطالعه کنید.

داروسازی

در داروسازی معمولاً از رقت های سریالی برای تعیین غلظت مورد نیاز یک ترکیب استفاده می شود.

برای مثال، فرض کنید که می‌خواهید اثربخشی چند داروی ضد میکروبی جدید را تعیین کنید. یک روش معمول برای انجام این کار، تعیین غلظت حداقل بازدارندگی (MIC) است که به عنوان کمترین غلظت ترکیب، برای مهار رشد پاتوژن تعریف می‌شود. برای این منظور، ابتدا یک رقت سریالی از ترکیبات در محیط کشت مایع ایجاد می‌کنید، سپس محیط را با پاتوژن تلقیح کرده و بعد از انکوباسیون، رشد میکروبی را اندازه‌گیری می‌کنید. اندازه‌گیری رشد میکروبی پس از انکوباسیون به شما این امکان را می‌دهد که کمترین غلظت مؤثر هر ترکیب را تعیین کنید. برای اطلاعات بیشتر در مورد آزمایش MIC، لطفاً به مقاله کاربردی ما درباره “آزمایش خودکار غلظت حداقل بازدارنده” مراجعه کنید.

منحنی‌های استاندارد
یک کاربرد رایج دیگر از رقت سریالی، رسم منحنی‌های استاندارد است. به عنوان مثال، هنگام انجام آزمایش‌های qPCR یا سنجش اسیدهای نوکلئیک با استفاده از فلورومتری، شما نیاز به انجام رقت سریالی از یک نمونه با مقدار شناخته‌شده از الگوی DNA دارید. مقایسه سیگنال‌های فلورسانسی نمونه‌های منحنی استاندارد با نمونه‌های شما که غلظت اسید نوکلئیک آن‌ها ناشناخته است، به شما این امکان را می‌دهد که مقدار DNA موجود در نمونه‌های خود را تعیین کنید.

روش‌های رقت سریالی
نسبت نمونه، معرف یا ماده شیمیایی به رقیق‌کننده به عنوان فاکتور رقت تعریف می‌شود. فاکتورهای رقت رایج دو و ده هستند، به همین دلیل است که ما اغلب از روش‌های رقت سریالی 2 برابر و 10 برابر صحبت می‌کنیم. در بخش‌های بعدی این دو تکنیک را توضیح خواهیم داد و شرایط استفاده از آن‌ها را بیان می‌کنیم، اما شما می‌توانید از هر عامل رقتی که برای آزمایش شما راحت‌تر است استفاده کنید.

رقت سریالی 10 برابری
در مثال اول، ما می‌خواستیم یک نمونه با غلظت باکتریایی بسیار بالا را به تعداد قابل‌شماری از سلول‌های باکتری رقیق کنیم، بنابراین 1 میلی‌لیتر از نمونه اصلی را در 9 میلی‌لیتر از رقیق‌کننده جدید رقیق کردیم. این بدان معنی است که فاکتور رقت ما ده بود و ما یک رقت سریالی 10 برابری انجام دادیم. این روش معمولاً زمانی استفاده می‌شود که بخواهید از یک غلظت بسیار بالا به غلظت بسیار پایین‌تری بروید و در عین حال از کمترین تعداد مرحله استفاده کنید.

رقت سریالی 2 برابری
در مثال دوم که در بالا توضیح داده شد، ما می‌خواستیم بدانیم که آیا ترکیبات ضدباکتری علیه یک پاتوژن خاص مؤثر هستند یا خیر. برای این کار، ما می‌خواستیم حداقل غلظت لازم برای مهار رشد پاتوژن را تعیین کنیم. برای این آزمایش، احتمالاً یک رقت سریالی 2 برابری ایجاد می‌کردیم، که در آن مقدار معینی از ترکیب – یا رقت قبلی – را با همان حجم از رقیق‌کننده تازه مخلوط می‌کردیم. مزیت این روش در مقایسه با رقت سریالی 10 برابری این است که مقادیر MIC دقیق‌تر است. فرض کنید که ترکیب در غلظت 10 µg/ml رشد پاتوژن را مهار می‌کند. اگر شما از یک غلظت اولیه 200 µg/ml از ترکیب شروع کنید و هم رقت سریالی 10 برابری و هم رقت سریالی 2 برابری را انجام دهید، از آزمایش رقت سریالی 10 برابری غلظت MIC برابر 20 µg/ml و از روش رقت سریالی 2 برابری غلظت MIC برابر 12.5 µg/ml خواهید داشت، همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است:

یک گزینه دیگر برای دستیابی به مقداری دقیق‌تر این است که ابتدا با رقت سریالی 10 برابری شروع کنید تا غلظت تقریبی ترکیب مورد نیاز برای مهار رشد پاتوژن را تعیین کنید و سپس رقت سریالی 2 برابری را انجام دهید و تمرکز خود را روی بازه بین 20 تا 2 µg/ml قرار دهید.

مراحل رقت سریالی
در حالی که کاربردهای مختلفی برای رقت‌های سریالی وجود دارد، روش خود همیشه مراحل دقیقا یکسانی را دنبال می‌کند:

1. انتخاب رقیق‌کننده: ابتدا باید رقیق‌کننده مناسب برای ماده‌ای که می‌خواهید آن را رقیق کنید، انتخاب کنید. بسیاری از ترکیبات را می‌توان با آب مقطر مخلوط کرد، اما برای باکتری‌ها یا سلول‌ها، به عنوان مثال، باید از محیط کشت تازه استفاده کرد.
2. پر کردن ظروف هدف با رقیق‌کننده: پس از انتخاب رقیق‌کننده، لوله‌ها یا چاهک‌هایی که قرار است رقت سریالی را در آن‌ها تنظیم کنید، با مقدار دلخواه رقیق‌کننده پر کنید (شکل 3، مرحله 1). اطلاعات بیشتر درباره نحوه محاسبه حجم رقیق‌کننده در قسمت‌های بعدی آمده است.
3. انجام اولین رقت: اطمینان حاصل کنید که نمونه، واکنش‌دهنده، ماده شیمیایی یا ترکیب مورد نظر شما به‌خوبی مخلوط شده است، سپس مقدار مشخصی از آن را به اولین لوله یا چاهک منتقل کنید (شکل 3، مرحله 2). اگر نمی‌دانید حجم انتقالی که باید برای آزمایش خود استفاده کنید چقدر است، به بخش “محاسبات رقت سریالی” مراجعه کنید.
4. انجام رقت دوم: اولین رقت را به‌خوبی مخلوط کنید (شکل 3، مرحله 3)، سپس همان حجم انتقالی که در مرحله قبلی استفاده کرده‌اید را از آن بردارید و به دومین لوله یا چاهک منتقل کنید (شکل 3، مرحله 4).
5. تکرار: فرایند مخلوط کردن جدیدترین رقت به‌دست‌آمده و انتقال مقداری از آن به لوله یا چاهک بعدی را ادامه دهید، تا زمانی که به انتهای آزمایش رقت سریالی خود برسید (شکل 3، مراحل 5-11).
6. دور انداختن حجم انتقالی: آخرین لوله یا چاهک شما مقدار بیشتری مایع از تمام رقت‌های قبلی خواهد داشت. برای برخی کاربردها، این اصلاً مشکلی ایجاد نمی‌کند. به عنوان مثال، وقتی که یک رقت سریالی از یک کشت باکتری در لوله‌ها انجام می‌دهید و می‌خواهید 1 میلی‌لیتر از هر لوله را با محیط کشت انکوبه کنید. اما در برخی موارد، حجم مایع در هر لوله یا چاهک باید برابر باشد، مانند زمانی که پلیت شما باید برای تحلیل به دستگاه خوانش بشقاب منتقل شود. در این حالت، حجم انتقالی را از آخرین لوله یا چاهک بردارید و در پایان تنظیم رقت سریالی خود دور بیندازید (شکل 4، مرحله 12).

محاسبات رقت سریالی
همانطور که قبلاً مشاهده کردیم، فاکتور رقت با توجه به کاربرد شما تعریف می‌شود و رایج‌ترین مقادیر آن دو و ده هستند. متغیر دیگری که باید بدانید، حجم نهایی است که پس از آخرین مرحله رقت سریالی برای کاربردها یا آنالیزهای بعدی نیاز دارید. با این دو مقدار، سپس می‌توانید به راحتی تمام پارامترهای دیگر مهم برای رقت‌های سریالی را محاسبه کنید.

برای مثال، با تقسیم حجم نهایی بر عامل رقت، می‌توانید حجم انتقالی نمونه، واکنش‌دهنده، ماده شیمیایی یا ترکیبی که باید به اولین لوله یا چاهک رقت سریالی اضافه کنید، و همچنین حجم انتقالی برای مراحل رقت بعدی را با استفاده از معادله زیر محاسبه کنید:

Final volume / dilution factor = transfer volume

کم کردن حجم انتقالی از حجم نهایی مورد نیاز، حجم رقیق‌کننده‌ای را که باید به لوله‌ها یا چاهک‌ها برای تنظیم رقت سریالی اضافه کنید، به‌دست می‌دهد:

Final volume – transfer volume = diluent volume

پس از محاسبه حجم‌های مورد نیاز برای رقیق‌کننده و انتقال، می‌توانید رقت سریالی را انجام دهید و کاربردها و آنالیزهای بعدی را انجام دهید. این کار به شما کمک می‌کند تا لوله یا چاهکی را شناسایی کنید که در آن غلظت نمونه، واکنش‌دهنده، ماده شیمیایی یا ترکیب به درستی تنظیم شده است تا نتیجه دلخواه شما به‌دست آید، مانند تعداد قابل شمارش سلول‌های باکتریایی یا مهار رشد یک پاتوژن.

پس از شناسایی این لوله یا چاهک، باید بدانید که فاکتور رقت نهایی آن چقدر است. این می‌تواند با ضرب عوامل رقت هر مرحله محاسبه شود. برای مثال، اگر یک رقت سریالی 7 مرحله‌ای 10 برابری انجام داده‌اید، عامل رقت نهایی آخرین لوله یا چاهک به‌صورت زیر خواهد بود:

10×10×10×10×10×10×10=107=10,000,00010 \times 10 \times 10 \times 10 \times 10 \times 10 \times 10 = 10^7 = 10,000,000

اگر غلظت نمونه، واکنش‌دهنده، ماده شیمیایی یا ترکیب اولیه خود را بدانید، می‌توانید غلظت لوله یا چاهکی که نتیجه دلخواه را ایجاد کرده است، به این صورت محاسبه کنید، به‌عنوان مثال برای یافتن غلظت مورد نیاز ترکیب برای مهار رشد پاتوژن:

Initial concentration / final dilution factor = required concentration

اگر غلظت اولیه را نمی‌دانید، اما غلظت لوله یا چاهکی که نتیجه دلخواه را ایجاد کرده است می‌دانید، به‌عنوان مثال چون تعداد کلونی‌های باکتریایی را که در محیط کشت رشد کرده‌اند شمرده‌اید، می‌توانید غلظت اولیه را به‌صورت زیر محاسبه کنید:

Measured concentration x final dilution factor = initial concentration

محدودیت‌های رقت سریالی
رقت‌های سریالی روش مناسبی برای تخمین غلظت یک آنالیت مورد نظر در یک نمونه یا برای کاهش سریع غلظت یک واکنش‌دهنده، ماده شیمیایی یا ترکیب هستند. با این حال، مانند هر تکنیک دیگر، این روش نیز محدودیت‌هایی دارد.

تکرارپذیری
یکی از چالش‌های اصلی در تنظیم رقت‌های سریالی، تکرارپذیری است. از آنجا که این روش شامل چندین مرحله است، کوچک‌ترین اشتباهات در استفاده از پیپت یا نادرستی‌ها در طول فرآیند، انباشته می‌شوند و بالاترین رقت، کم‌دقت‌ترین و کم‌صحت‌ترین خواهد بود. با فرض اینکه پیپت‌های شما به درستی نگهداری و کالیبره شده‌اند، تاثیر انسان بزرگ‌ترین عامل در نتایج شما است. بنابراین، رعایت اصول صحیح استفاده از پیپت بسیار مهم است.

اصول صحیح استفاده از پیپت
قبل از شروع رقت سریالی، باید نوک پیپت خود را مرطوب کنید. این کار را با کشیدن و تخلیه حجم کامل رقیق‌کننده دو تا سه بار انجام دهید. این روش نه تنها اختلاف دمای بین مایع و نوک پیپت را تنظیم می‌کند، بلکه فضای هوای مرده داخل پیپت و نوک آن را نیز مرطوب می‌کند. عدم انجام این مرحله مرطوب‌سازی می‌تواند منجر به حجم تحویلی کمتر در چند مرحله اول شود که خطاهایی را در مراحل بعدی رقت به همراه خواهد داشت.

حجم مایع در نوک پیپت تحت تاثیر زاویه و عمق فروبردن پیپت هنگام کشیدن مایع قرار می‌گیرد. بنابراین، مهم است که پیپت خود را در طول کل سری رقت در یک زاویه ثابت نگه دارید که حداکثر ۲۰ درجه از عمودی باشد. علاوه بر این، باید نوک پیپت را دقیقاً زیر سطح مایع فرو ببرید تا حجم مورد نظر به درستی کشیده شود. اگر نوک پیپت بیش از حد به داخل مایع فرو رود، خطر انتقال مایع به دلیل چسبیدن قطرات مایع به سطح بیرونی نوک پیپت افزایش می‌یابد.

که می‌توانند نتایج مخلوط‌سازی را بهبود بخشند عبارتند از تعداد بیشتر چرخه‌های مخلوط‌سازی و حجم مخلوط بزرگتر. با این حال، نباید این موارد را به طور غیر ضروری افزایش دهید، زیرا این امر زمان آماده‌سازی آزمایش را به طور قابل توجهی طولانی می‌کند. علاوه بر این، باید مراقب ارتفاع‌های جذب و تزریق در حین مراحل مخلوط‌سازی باشید. مخلوط‌سازی با نوک پیپت در پایین‌ترین نقطه لوله یا چاه منجر به مخلوط‌سازی ضعیف‌تری می‌شود، زیرا حرکت ناکافی مایعات ایجاد می‌شود. ایده‌آل این است که مایع را نزدیک به سطح مایع تزریق کنید و از وسط آن را جذب کنید. با این حال، باید مراقب باشید که در حین مخلوط‌سازی، نوک پیپت را از مایع خارج نکنید تا از ورود هوا به داخل جلوگیری کنید.

اگر می‌خواهید بیشتر در مورد راه‌حل‌های ما برای تسهیل رقت‌های سری بدانید، لطفاً به مقالات زیر مراجعه کنید:

• پیپت‌زدن اتوماتیک رقت‌های سری برای تست MIC
• رقت سری در صفحات ۹۶ و ۳۸۴ چاه
• ۳ پروتکل ساده و اثبات‌شده برای رقت سری بر روی ربات پیپت ASSIST PLUS
•  

برای مثال، اگر شما ترکیب نمونه و رقیق‌کننده‌ای به حجم 10 میلی‌لیتر داشته باشید که شامل 3000 سلول باکتریایی باشد، ممکن است انتظار داشته باشید که با انتقال 1 میلی‌لیتر به لوله بعدی، غلظت سلول‌ها به 300 سلول برسد. اما به‌دلیل این که ترکیب به‌طور کامل همگن نیست، ممکن است تعداد سلول‌های منتقل شده کمی متفاوت باشد؛ برای مثال فقط 298 سلول منتقل شود. بنابراین، غلظت‌هایی که از طریق رقیق‌سازی سریالی ذرات یا سلول‌ها محاسبه می‌شود، باید به‌عنوان تخمین‌هایی در نظر گرفته شوند نه مقادیر دقیق.

نتیجه‌گیری

 رقیق سازی سریالی یک تکنیک بسیار متنوع است و در زمینه‌های مختلف کاربرد دارد، اما این روش همیشه با انجام یک سری مراحل ساده پپتینگ به‌طور مشابه انجام می‌شود. متاسفانه، اجرای دستی این مراحل می‌تواند چالش‌برانگیز باشد زیرا کوچک‌ترین اشتباهات در نحوه هندلینگ مایع در طول فرآیند جمع می‌شود و منجر به نتایج نامناسب می‌شود. برای کاهش این مشکلات، استفاده از پپت‌های بنچ‌تک 96 یا 384 کاناله یا روبات‌های پپتینگ کوچک می‌تواند به حفظ ثبات پارامترهای پپتینگ کمک کند و نتایج قابل اعتمادتری در تمام مراحل رقیق‌سازی سریالی به‌دست آورد.